Teste de Bacillus Subtilis em Preparações Microbianas Alimentares

ICS 65.120                                                                                                                  Classificação nº: B 46

GB/T 26428-2010

PPadrões Nacionais da República da China de pessoas

Padrão de teste para Bacillus subtilis em feeds

Emitido em: 2011-01-14                                                                                  

Implementado: 2011-07-01 

Publicado por:PRepública da China Administração Geral de Supervisão de Qualidade, Inspeção e Quarentena e Comitê Nacional de Gestão de Padronização da China

Prefácio

Este padrão é elaborado de acordo com os regulamentos de GB/T 1.1-2009.

Esta norma está sob a jurisdição do Comitê Técnico Nacional de Padronização da Indústria de Alimentos para Animais (SAC/TC 76).

Este padrão foi proposto e elaborado por: O Centro de Análise e Testes Microbiológicos da Província de Guangdong.

Os principais redatores desta norma são: Honghui Zhu, Xiaotang Sun, Songzhen Yang, Yuanliang Chen e Xianjiao Zhang.

Teste de Bacillus Subtilis em Preparações Microbianas Alimentares

1. Âmbito de aplicação

Esta norma define os regulamentos para o teste de bacillus subtilis em preparações microbianas para alimentação animal.

Esta norma é aplicável aos testes e cálculos de bacillus subtilis em preparações microbianas para rações.

2. Referências normativas

Os seguintes documentos são essenciais para a aplicação deste documento. Para referências datadas, somente a versão datada se aplica a este documento. Para documentos citados sem data, a versão mais recente (incluindo todas as alterações) se aplica a este documento:

GB/T 8170 Regras de Arredondamento Numérico e Expressão e Julgamento de Valores Limite

GB/T 14699,1 Amostragem de Alimentação (GB/T 14699,1 – 2005, ISO 6497: 2002, IDT)

GB/T 20195 Ração Animal: Preparação de Amostras (GB/T 20195 – 2006, ISO 6498: 1998, IDT)

3. Diluentes, Meios e Reagentes

A menos que especificado de outra forma, apenas reagentes analiticamente puros e água destilada ou desionizada ou equivalentemente pura devem ser usados ​​na análise.

3.1.  Solução Salina Esterilizada a 0,85%

3.2.  Meio Agar Nutricional (NA), ver A.1 do Apêndice A

3.3.  Solução de coloração de Gram, consulte A.2 do Apêndice A

3.4.  Meio de crescimento de cloreto de sódio a 7%, consulte A.3 do Apêndice A

3.5.  Teste VP de meios e reagentes, consulte A.4 do Apêndice A

3.6.  Meio de redução de nitrato e reagentes, consulte A.5 do Apêndice A

3.7.  Meio de fermentação D-manitol, ver A.6 do Apêndice A

3.8.  Meio de utilização de propionato, consulte A.7 do Apêndice A

4. Equipamentos e Vidrarias

Além dos equipamentos de laboratório comumente usados ​​em microbiologia, outros equipamentos e vidrarias listados a seguir:

4.1.  Incubadora Termostática: 37 ºC ± 1 ºC

4.2.  Medidor de pH, com precisão de ± 0,1 unidades

4.3.  Placa de Petri de vidro ou plástico

4.4.  Pipeta escalonada com capacidades de marcação de 1 ml e 10 ml, com escala mínima de 0,1 ml e 0,5 ml respectivamente

4.5.  Haste revestida de vidro ou plástico

4.6.  Microscópio, com zoom de 1000 vezes

5. Amostragem

As amostras de teste são reais e representativas. Ferramentas de amostragem como pás, colheres de amostra, tubos de ensaio, potes, tesouras, etc. devem ser esterilizados.

As amostras devem ser enviadas para a sala de testes microbiológicos o mais rápido possível. O tamanho e o método de amostragem devem ser implementados de acordo com GB/T 14699.1.

6. Preparação da Amostra

A preparação da amostra deve ser implementada de acordo com GB/T 20195, e a amostra deve ser inspecionada o mais rápido possível após a preparação.

7. Procedimentos de Operação

7.1. Preparação de Amostra para Inspeção e Suspensão Inicial e Diluição Dez Vezes.

Utilizando operações e condições assépticas, pesar 25 g (ml) da amostra, adicionar 225 ml de soro fisiológico 0,85% esterilizado, homogeneizar por 1-2 min e fazer uma suspensão inicial de 1:10. Em seguida, retirar 1 ml da suspensão inicial de 1:10, adicionar 9 ml de soro fisiológico 0,85% esterilizado e misturar bem para fazer uma diluição de 1:100. De acordo com o conteúdo bacteriano da amostra, faça ainda uma diluição em série de dez vezes.

7.2.  Inoculação e Cultura

Escolher 2-3 diluições adequadas, manter e manter por 10 min em banho-maria a 80 ºC ± 1 ºC, retirar 0,1 ml com uma pipeta estéril e inocular duas placas de ágar nutricional (3.2). Use a vareta de revestimento para aplicar o inóculo na superfície do ágar da forma mais cuidadosa e rápida possível. A haste de revestimento não deve tocar a borda da placa de Petri. Use uma haste de revestimento estéril para cada prato. Cubra a placa de Petri revestida e deixe em temperatura ambiente por 15 min, para que o inóculo seja completamente absorvido pelo ágar. Inverter a placa e colocar na incubadora a 37 ºC ± 1 ºC por 48 ± 2 h.

7.3. Contagem e triagem de colônias

Após a incubação, selecione uma placa com uma contagem de colônias entre 30-300. Se grandes colônias em forma de flocos crescerem no prato, ele não será declarado para uso. No entanto, se as colônias em forma de flocos forem menos da metade do prato, e a distribuição das colônias na metade restante for muito uniforme, você pode calcular metade da contagem de colônias no prato e multiplicar o resultado por 2 para representar o contagem total de colônias do prato. A colônia de Bacillus Subtilis típico é áspera, opaca, sem brilho, com bordas dilatadas, redondas ou onduladas, de formato irregular e aparência branca acinzentada ou amarelada. Por fim, selecione 5 colônias que apresentam essas características para confirmação do experimento.

7.4. Teste de confirmação

7.4.1. Visão geral

Atualmente, se o meio de cultura usado em kits de identificação bioquímica comercial ou tubos de identificação bioquímica for o mesmo que o meio usado nos testes de confirmação desta norma, esses kits ou tubos podem ser usados ​​de acordo com as instruções da mercadoria para realizar esta confirmação experimentar.

7.4.2. Preparação de cepas

Escolha uma única colônia da placa de Petri e estique a cultura na placa de ágar nutricional e cultive a 37 ºC ± 1 ºC, por 48 ± 2 h. Pelo menos uma colônia característica bem isolada deve ser retirada de cada placa, semeada e transferida para a placa de ágar e armazenada para teste de confirmação.

7.4.3. Observação morfológica

As colônias purificadas selecionadas foram examinadas por microscopia de coloração de Gram (3.3). As células do Bacillus subtilis devem ser em forma de bastonete, com esporos ovais, mesozóicos ou próximos do mesozóico, e os cistos não devem ser aumentados de forma significativa.

7.4.4. Teste de Confirmação Fisioquímica

As colônias purificadas foram selecionadas para o teste de: crescimento de cloreto de sódio a 7% (3,4), teste de VP (3,5), redução de nitrato (3,6), fermentação de D-manitol (3,7) e utilização de propionato (3,8).

7.4.5. Confirmação de Resultados

A confirmação dos resultados está listada abaixo:

1. As colônias de Bacillus Subtilis têm superfícies ásperas, são opacas, de aparência branca acinzentada ou amarelada, são em forma de bastonete com esporos ovais, mesozóicos ou próximos do mesozóico, com cistos que não são significativamente aumentados.

2. Os resultados do teste são positivos para crescimento de cloreto de sódio a 7%, teste de VP e redução de nitrato.

3. O ácido pode ser produzido através da fermentação do D-manitol.

4. Ele pode ser julgado e determinado como Bacillus Subtilis sem o uso de propionato.

As características distintivas de Bacillus Subtilis e bactérias semelhantes a Bacillus são mostradas abaixo na Tabela 1.

Tabela 1. Características distintivas de Bacillus Subtilis e Bacillus-like Bacillus

8. Cálculo de Resultados e Relatório

8.1.  Calculando o número de colônias de Bacillus Subtilis em cada prato.

Calcule o número de colônias de Bacillus Subtilis (uma) em cada prato usando a Fórmula 1:

Fórmula 1

a =(b ÷ A) x C

Lenda:

uma:Número de colônias de Bacillus Subtilis em cada placa;

b:Número de colônias confirmadas como colônias de Bacillus Subtilis após a seleção da amostra;

UMA:Número de colônias selecionadas para confirmação (5);

C:Número de colônias no prato que incorpora as características distintivas de Bacillus subtilis

O resultado final (uma) deve ser arredondado para o número inteiro mais próximo de acordo com as regras de arredondamento numérico em GB/T 8170.

Por exemplo:

Se houver um total de 78 colônias na placa que apresentam características de Bacillus Subtilis, 5 são selecionadas para o teste de confirmação e 4 das quais são confirmadas como colônias de Bacillus Subtilis, então:

uma= (4/5) x 78 = 62,4

uma= 62,4 ~ 62

De acordo com as regras de arredondamento numérico em GB/T 8170, o número de colônias de Bacillus Subtilis (uma) neste prato é 62.

8.2.  Número de Colônias de Bacillus Subtilis na Amostra: Método de Cálculo e Relatório

Escolha 2 pratos de diluição em série (cada diluição deve ter pelo menos um prato, com um número confirmado de Bacillus Subtilis entre 30 – 300 no prato.), calcule usando a Fórmula 2, que é 1 ml ou 1 g de Bacillus Subtilis na amostra , N

Fórmula 2

N = Ʃuma /V (n₁ + 0,1n₂) · d

Lenda:

N:O número total de Bacillus Subtilis na amostra;

Ʃuma:A soma total de Bacillus Subtilis confirmado em todos os pratos;

DENTRO:Volume de inoculação da placa, ml;

n₁:Número de pratos para a primeira diluição;

n₂:Número de pratos para a segunda diluição;

d:O fator de diluição da primeira diluição (o valor dedpara amostras não diluídas é 1).

O resultado final (N) deve ser arredondado para os 2 dígitos significativos mais próximos de acordo com as regras de arredondamento numérico em GB/T 8170. O número de colônias de Bacillus Subtilis na amostra também pode ser registrado usando Notação Científica (1,0 – 9,9 vezes 10^x).

Relate o número estimado de Bacillus Subtilis por ml ou g da amostra, UFC/g ou UFC/ml.

Exemplo 1:

Se após a primeira diluição (10^-3), o número confirmado de colônias de Bacillus Subtilis são 168 e 215 respectivamente, e após a segunda diluição (10^-4), o número confirmado de colônias de Bacillus Subtilis são 34 e 35 respectivamente, então:

N = (168 + 215 + 34 + 35) / [0,1 x (2 + 0,1 · 2) x 10^-3]

N = 472 / 0,00022

N = 2145450 ~ 2100000

De acordo com as regras de arredondamento numérico em GB/T 8170, o número estimado de Bacillus Subtilis da amostra neste exemplo em unidades de g ou ml é 2100000 UFC/g (ou ml), ou 2,1 x 10⁶ UFC/g (ou ml).

Exemplo 2:

Se a última diluição (10^-4) confirma que o número de colônias de Bacillus Subtilis é 120 e 130 respectivamente, então:

N = (120 + 130) / (0,1 x 2 x 10^-4)

N = 250 / 0,00002

N = 12500000 ~ 12000000

De acordo com as regras de arredondamento numérico em GB/T 8170, o número estimado de Bacillus Subtilis da amostra neste exemplo em unidades de g ou ml é 12000000 UFC/g (ou ml), ou 1,2 x 10⁷ UFC/g (ou ml).