Qual é o método de detecção da atividade da protease alcalina?
Qual é o método de detecção da atividade da protease alcalina?
A atividade enzimática refere-se à capacidade de uma enzima catalisar certas reações químicas. O tamanho da atividade da enzima pode ser expresso pela velocidade de uma determinada reação química que catalisa nas condições correspondentes. Medir a atividade da enzima protease alcalina Liaoning é realmente medir a velocidade da reação química catalisada pela enzima. A velocidade da reação enzimática pode ser expressa pela diminuição do substrato da reação ou pelo aumento do produto por unidade de tempo. Por uma questão de sensibilidade, a quantidade de produto produzido por unidade de tempo é geralmente medida. Como a velocidade da reação enzimática pode diminuir gradualmente seu valor de aumento ao longo do tempo, para medir corretamente a atividade enzimática, a velocidade inicial da reação enzimática deve ser determinada.
Princípio da determinação da atividade da protease alcalina Princípio do método Folin
A protease alcalina pode catalisar a hidrólise da caseína em tirosina em condições alcalinas. A tirosina é um aminoácido que contém um grupo hidroxil fenólico e pode reagir com Folin (uma mistura de ácido fosfotúngstico e ácido fosfomolibdico). (Reação de fenol de folina: o reagente de folina é extremamente instável sob condições alcalinas e é fácil ser quantitativamente reduzido por compostos fenólicos para produzir uma mistura de azul de tungstênio e azul de molibdênio, mostrando uma tonalidade diferente de azul.) pode ser determinada a quantidade de tirosina produzida e a quantidade de tirosina produzida pela hidrólise da caseína pela protease alcalina de Liaoning em um tempo unitário é usada para expressar a atividade enzimática, calculando assim a atividade enzimática.
Procedimento experimental para determinação da atividade da protease alcalina
Preparação da solução enzimática: pesar com precisão 1 g (± 0,001) de pó de enzima seca, adicionar 10 ml de solução tampão (2.2.5), dissolver em um copo pequeno e mexer com uma haste de vidro. Depois de repousar um pouco, despeje cuidadosamente a solução da camada superior em um balão volumétrico. No meio, adicione uma pequena quantidade de solução tampão à parte do sedimento, mexa e dissolva 4 vezes dessa maneira e, finalmente, transfira tudo para um balão volumétrico de 100 ml. . Perfazer a marca com solução tampão, agitar bem e filtrar com quatro camadas de gaze. Retire 5 ml do filtrado, transfira-o para um balão volumétrico de 100 ml, dilua até a marca com água destilada e dilua o líquido da enzima com um nível de 2000 vezes.
Definição da atividade da protease alcalina
Definição da unidade de atividade da protease alcalina: 1 grama de pó de protease alcalina pode produzir 1 micrograma de tirosina por minuto nas condições de pH 10 e 40 ° C, o que é considerado uma unidade de atividade enzimática.
Precauções para determinação da atividade da protease alcalina
1. A temperatura, o pH e o tempo da reação enzimática têm um impacto direto no número de ligações peptídicas hidrolisadas, por isso devem ser rigorosamente controladas.
2. Após o término da reação com ácido tricloroacético, o filtrado obtido por filtração da mistura de reação deve ser límpido.
3. Como o reagente Folin é sensível ao ambiente ácido e propenso a alterações, há uma estipulação na ordem durante a medição. É necessário adicionar solução de carbonato de sódio para formar um ambiente alcalino e, em seguida, adicionar reagente Folin para fazê-lo funcionar normalmente.
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